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Protein Deglycosylation Kit Ⅰ (for O-linked Glycans)

Rhinogen® Protein Deglycosylation KitⅠ(for O-linked Glycans)具有稳定性高、比活性高等特点,是两种高度纯化和非常稳定的糖苷酶的组合,适用于蛋白质组学及糖生物学研究中糖蛋白上常见O-连聚糖的有效释放。

高纯度:没有污染蛋白酶/其它糖苷酶,纯度≥95%;

高稳定性:每批Kit试剂盒中酶及试剂都经过严格的质量控制,以实现高稳定性;

高比活性:有效释放糖蛋白上唾液酸修饰O-连聚糖;

HPLC、MS兼容:试剂盒中所有的酶及试剂与下游HPLCMS兼容。



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QPF-008
1 kit
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产品概述

背景:

       Rhinogen® Protein Deglycosylation KitⅠ(for O-linked Glycans)包含O-Glycosidaseα2-3,6,8,9 Neuraminidase,二者均是重要的糖基化研究的工具酶,组合用于糖蛋白O-连糖链的酶切释放。Rhinogen® O-Glycosidase能够将糖蛋白中SerThr残基的羟基连接的Core 1Gal-β(1-3)-GalNAc-)及Core 3GlcNAc-β(1-3)-GalNAc-O-连双糖释放下来,如图1。核心结构的任何修饰都可以阻断O-Glycosidase的作用,最常见的修饰是核心结构的单、二或三唾液酸化。Rhinogen® α2-3,6,8,9 Neuraminidase能够释放O-连糖链非还原末端α (2,3)-, α (2,6)-, α (2,8)-, α (2,9)-唾液酸残基,如图2,不同唾液酸残基的释放速率大致为α (2,6)-α (2,3)- α (2,8)- α (2,9)-。唾液酸酶的这种组合模式使得O-连糖链的酶切释放更彻底。该Kit包含的所有酶及试剂均与下游HPLCMS兼容。

1. O-Glycosidaseα2-3,6,8,9 Neuraminidase组合用于糖蛋白O-连糖链的酶切释放



2. Rhinogen® α2-3,6,8,9 Neuraminidase作用位点


包装规格:

       Rhinogen® Protein Deglycosylation KitⅠ(for O-linked Glycans)包装规格如下:

     目录号                               组成
           规格
  体积
   QPF-008

O-Glycosidase

α2-3,6,8,9Neuraminidase

     1,200,000U

          0.6U

  30μl

  30μl

配套试剂:

       Rhinogen® Protein Deglycosylation KitⅠ(for O-linked Glycans)提供的配套试剂如下:

                  试剂
                               成分
10×Denaturing缓冲液
5%SDS,0.4M DTT
10×Glyco缓冲液2
0.5MSodium Phosphate(pH7.5 at 25°C)
10%NP-40溶液
10%NP-40

产品来源:

       本试剂盒中的所有酶都是大肠杆菌BL21中表达并分离纯化的重组酶:O-Glycosidase基因来源于Enterococcus Faecalis,分子量为147kDa;α2-3,6,8,9 Neuraminidase基因来源于Arthrobacter ureafaciens,分子量为66KDa。

产品质量:

       SDS-PAGE分析,纯度≥95%;没有检测到污染的糖苷外切酶、糖苷内切酶及蛋白酶活性。

酶活定义:

       1个O-Glycosidase酶活力单位定义:在100 μl反应体系中,37°C,pH7.5条件下,1小时内从5mg唾液酸酶消化后的非变性fetuin 上催化释放0.68nmol O-连二糖所需要的酶量。1U Rhinogen® O-Glycosidase =1 unit NEB O-Glycosidase。

       1个α2-3,6,8,9 Neuraminidase酶活力单位定义:在37°C,pH5.5条件下,以对硝基苯基-α-D-N-乙酰神经氨酸为底物,1分钟内催化释放1 μmol 对硝基苯酚所需要的酶量。1U Rhinogen® α2-3,6,8,9 Neuraminidase =1 U Prozyme Glyko® Sialidase ATM。

储存条件: 

       -20°C。

产品特点:

       Rhinogen® Protein Deglycosylation KitⅠ(for O-linked Glycans)具有稳定性高、比活性高等特点,是两种高度纯化和非常稳定的糖苷酶的组合,适用于蛋白质组学及糖生物学研究中糖蛋白上常见O-连聚糖的有效释放。

1. 高纯度:没有污染蛋白酶/其它糖苷酶,纯度≥95%;

2. 高稳定性:每批Kit试剂盒中酶及试剂都经过严格的质量控制,以实现高稳定性;

3. 高比活性:有效释放糖蛋白上唾液酸修饰O-连聚糖;

4. HPLC、MS兼容:试剂盒中所有的酶及试剂与下游HPLCMS兼容。

应用:

1. 聚糖结构分析;

2. 结合位点及功能分析;

3. 治疗性糖蛋白的表征及质量控制;

4. 蛋白质组学分析,消除糖蛋白的异质性。

使用建议:

       变性条件下去糖基化方案:

1. 取10-100µg糖蛋白溶液,加入1µl 10×Denaturing缓冲液,补加纯化水使得反应体系为10µl;

2. 将上述10µl体系100℃处理10min,使糖蛋白完全变性;

3. 室温冷却5min;

4. 在上述变性体系中,分别加入2µl 10×Glyco缓冲液2、2µl 10% NP-40溶液、1-4μl O-Glycosidase、1-2μl α2-3.6.8.9Neuraminidase,补加纯化水至反应总体积为50μl,轻柔混匀;

5. 37°C 条件下反应1-5hr;

注意:对于不同的糖蛋白样品,需要实验摸索最适的酶浓度及反应时间。


       非变性条件下去糖基化方案:

1. 10-100µg糖蛋白底物溶液,加入2µl 10×Glyco缓冲液2、纯化水及1-4μl O-Glycosidase、1-2μl α2-3.6.8.9Neuraminidase,使得总反应体积为20µl,轻柔混匀;

2. 37°C 条件下反应1-4hr。

注意:通常情况下,糖蛋白变性与否不显著影响O-连糖链去除的效率,但也不排除个例,建议根据自己的底物特性,选择合适的方法。

当对天然糖蛋白去糖基化时,建议将等量糖蛋白样品进行变性后再同步进行酶切作为阳性对照,以确定非变性条件下去糖基化反应的程度。

操作说明:

1. 上述操作方法旨在Rhinogen® Protein Deglycosylation KitⅠ(for O-linked Glycans)作为去糖基化试剂操作的一般指南,对于不同的糖蛋白样品,去糖基化活性高度依赖于反应条件,建议进行适当优化或根据经验确定最优的操作方法;

2. 去糖基化体系可以线性放大或缩小;

3. 由于变性缓冲液中含有SDS,SDS会抑制Rhinogen® O-Glycosidase的活性,因此在变性糖蛋白反应体系中需加入终浓度为1%NP-40,其能有效解除SDSO-Glycosidase酶活的抑制;

4. 本产品适用于天然或者变性糖蛋白,对于天然糖蛋白的去糖基化,可能需要更多的酶及更长的反应时间;

5. EDTA、对氯丙基苯磺酸、Mn2+、Zn2+O-Glycosidase的酶活有一定的抑制作用,1mM各物质存在条件下,酶活回收率分别为63%、60%、44%、66%%;

6. 本产品仅供研究使用,不适用于人或动的物诊断及治疗用途。













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常见问题

此试剂盒与下游HPLC及MS兼容吗?

是的,Rhinogen® Protein Deglycosylation Kit Ⅰ (for O-linked Glycans )所有的酶及缓冲试剂均与下游HPLC及MS应用兼容。可以采用微透析或微量过滤制备HPLC及MS分析的蛋白。



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