背景：

       Rhinogen^® Protein Deglycosylation KitⅠ(for O-linked Glycans)包含O-Glycosidase及α2-3,6,8,9 Neuraminidase，二者均是重要的糖基化研究的工具酶，组合用于糖蛋白O-连糖链的酶切释放。Rhinogen^® O-Glycosidase能够将糖蛋白中Ser或Thr残基的羟基连接的Core 1（Gal-β(1-3)-GalNAc-）及Core 3（GlcNAc-β(1-3)-GalNAc-）O-连双糖释放下来，如图1。核心结构的任何修饰都可以阻断O-Glycosidase的作用，最常见的修饰是核心结构的单、二或三唾液酸化。Rhinogen^® α2-3,6,8,9 Neuraminidase能够释放O-连糖链非还原末端α (2,3)-, α (2,6)-, α (2,8)-, α (2,9)-唾液酸残基，如图2，不同唾液酸残基的释放速率大致为α (2,6)-＞α (2,3)- ＞α (2,8)- ＞α (2,9)-。唾液酸酶的这种组合模式使得O-连糖链的酶切释放更彻底。该Kit包含的所有酶及试剂均与下游HPLC及MS兼容。

图1. O-Glycosidase与α2-3,6,8,9 Neuraminidase组合用于糖蛋白O-连糖链的酶切释放

图2. Rhinogen^® α2-3,6,8,9 Neuraminidase作用位点

包装规格：

       Rhinogen^® Protein Deglycosylation KitⅠ(for O-linked Glycans)包装规格如下：

目录号	组成	规格	体积
QPF-008	O-Glycosidase α2-3,6,8,9Neuraminidase	1,200,000U           0.6U	30μl   30μl

配套试剂：

       Rhinogen^® Protein Deglycosylation KitⅠ(for O-linked Glycans)提供的配套试剂如下：

试剂	成分
10×Denaturing缓冲液	5%SDS,0.4M DTT
10×Glyco缓冲液2	0.5MSodium Phosphate(pH7.5 at 25°C)
10%NP-40溶液	10%NP-40

产品来源：

       本试剂盒中的所有酶都是大肠杆菌BL21中表达并分离纯化的重组酶：O-Glycosidase基因来源于Enterococcus Faecalis，分子量为147kDa；α2-3,6,8,9 Neuraminidase基因来源于Arthrobacter ureafaciens，分子量为66KDa。

产品质量：

       SDS-PAGE分析，纯度≥95%；没有检测到污染的糖苷外切酶、糖苷内切酶及蛋白酶活性。

酶活定义：

       1个O-Glycosidase酶活力单位定义：在100 μl反应体系中，37°C，pH7.5条件下，1小时内从5mg唾液酸酶消化后的非变性fetuin 上催化释放0.68nmol O-连二糖所需要的酶量。1U Rhinogen^® O-Glycosidase =1 unit NEB O-Glycosidase。

       1个α2-3,6,8,9 Neuraminidase酶活力单位定义：在37°C，pH5.5条件下，以对硝基苯基-α-D-N-乙酰神经氨酸为底物，1分钟内催化释放1 μmol 对硝基苯酚所需要的酶量。1U Rhinogen^® α2-3,6,8,9 Neuraminidase =1 U Prozyme Glyko^® Sialidase ATM。

储存条件： 

       -20°C。

产品特点：

       Rhinogen^® Protein Deglycosylation KitⅠ(for O-linked Glycans)具有稳定性高、比活性高等特点，是两种高度纯化和非常稳定的糖苷酶的组合，适用于蛋白质组学及糖生物学研究中糖蛋白上常见O-连聚糖的有效释放。

1. 高纯度：没有污染蛋白酶/其它糖苷酶，纯度≥95％；

2. 高稳定性：每批Kit试剂盒中酶及试剂都经过严格的质量控制，以实现高稳定性；

3. 高比活性：有效释放糖蛋白上唾液酸修饰O-连聚糖；

4. HPLC、MS兼容：试剂盒中所有的酶及试剂与下游HPLC及MS兼容。

应用：

1. 聚糖结构分析;

2. 结合位点及功能分析;

3. 治疗性糖蛋白的表征及质量控制;

4. 蛋白质组学分析，消除糖蛋白的异质性。

使用建议：

       变性条件下去糖基化方案：

1. 取10-100µg糖蛋白溶液，加入1µl 10×Denaturing缓冲液，补加纯化水使得反应体系为10µl；

2. 将上述10µl体系100℃处理10min，使糖蛋白完全变性；

3. 室温冷却5min；

4. 在上述变性体系中，分别加入2µl 10×Glyco缓冲液2、2µl 10% NP-40溶液、1-4μl O-Glycosidase、1-2μl α2-3.6.8.9Neuraminidase，补加纯化水至反应总体积为50μl，轻柔混匀；

5. 37°C 条件下反应1-5hr；

注意：对于不同的糖蛋白样品，需要实验摸索最适的酶浓度及反应时间。

       非变性条件下去糖基化方案：

1. 取10-100µg糖蛋白底物溶液，加入2µl 10×Glyco缓冲液2、纯化水及1-4μl O-Glycosidase、1-2μl α2-3.6.8.9Neuraminidase，使得总反应体积为20µl，轻柔混匀；

2. 37°C 条件下反应1-4hr。

注意：通常情况下，糖蛋白变性与否不显著影响O-连糖链去除的效率，但也不排除个例，建议根据自己的底物特性，选择合适的方法。

当对天然糖蛋白去糖基化时，建议将等量糖蛋白样品进行变性后再同步进行酶切作为阳性对照，以确定非变性条件下去糖基化反应的程度。

操作说明：

1. 上述操作方法旨在为Rhinogen^® Protein Deglycosylation KitⅠ(for O-linked Glycans)作为去糖基化试剂操作的一般指南，对于不同的糖蛋白样品，去糖基化活性高度依赖于反应条件，建议进行适当优化或根据经验确定最优的操作方法；

2. 去糖基化体系可以线性放大或缩小；

3. 由于变性缓冲液中含有SDS，而SDS会抑制Rhinogen^® O-Glycosidase的活性，因此在变性糖蛋白反应体系中需加入终浓度为1%的NP-40，其能有效解除SDS对O-Glycosidase酶活的抑制；

4. 本产品适用于天然或者变性糖蛋白，对于天然糖蛋白的去糖基化，可能需要更多的酶及更长的反应时间；

5. EDTA、对氯丙基苯磺酸、Mn²⁺、Zn²⁺对O-Glycosidase的酶活有一定的抑制作用，1mM各物质存在条件下，酶活回收率分别为63%、60%、44%、66%%；

6. 本产品仅供研究使用，不适用于人或动的物诊断及治疗用途。