背景：

       Rhinogen^® Protein Deglycosylation KitⅡ(for N-Linked & Simple O-Linked Glycans)包含去除所有N-连和相对简单O-连聚糖所需要的酶及试剂。其中的酶试剂是三种糖苷酶的混合物，包括PNGase F、O-Glycosidase、α2-3.6.8.9Neuraminidase。该试剂盒包含的所有酶及试剂均与下游HPLC及MS兼容。PNGase F是从糖蛋白中特异性除去N-连聚糖的糖苷内切酶，能够将绝大多数N-糖链（除最内测GlcNac上连有α-1,3岩藻糖残基，常见于植物及昆虫糖蛋白）完整地从其所连接的蛋白分子上释放下来，可以在N-连糖肽或糖蛋白的高甘露糖、杂合和复杂寡糖部分最内侧的N-乙酰葡萄糖胺（GlcNAc）和天冬酰氨残基（Asn）之间进行切割，释放出完整的寡糖链，如图1。

图1. PNGase F可以从糖蛋白或糖肽上切割释放几乎所有类型的N-连糖链

       但是对于O-连聚糖，由于没有一种像PNGase F的“通用”糖苷内切酶，必须通过一系列糖苷酶除去单糖。Rhinogen^® O-Glycosidase及α2-3,6,8,9 Neuraminidase组合用于糖蛋白唾液酸修饰的O-连糖链的酶切释放，Rhinogen^®α2-3,6,8,9 Neuraminidase能够释放O-连糖链非还原末端α (2,3)-, α (2,6)-, α (2,8)-, α (2,9)-唾液酸残基。在去除末端唾液酸残基的修饰后，Rhinogen^® O-Glycosidase能够将糖蛋白中Ser或Thr残基的羟基连接的Core 1（Gal-β(1-3)-GalNAc-）及Core 3（GlcNAc-β(1-3)-GalNAc-）O-连双糖释放下来，如图2。

图2. Rhinogen^® O-Glycosidase及α2-3,6,8,9 Neuraminidase组合用于常见二或三唾液酸修饰的O-连糖链的酶切释放

包装规格：

       Rhinogen^® Protein Deglycosylation KitⅡ(for N-Linked & Simple O-Linked Glycans)包装规格如下：

目录号	组成	规格	体积
QPF-009	PNGase F (Glycerol-free)   O-Glycosidase                    α2-3,6,8,9 Neuraminidase	15,000U     1,200,000U        0.6U	30μl   30μl   30μl

配套试剂：

       Rhinogen^® Protein Deglycosylation KitⅡ(for N-Linked & Simple O-Linked Glycans)配套提供的试剂如下：

试剂	成分
10×Denaturing缓冲液	5%SDS,0.4M DTT
10×Glyco缓冲液2	0.5MSodium Phosphate(pH7.5 at 25°C)
10%NP-40溶液	10%NP-40

产品来源：

       本试剂盒中的所有酶都是大肠杆菌BL21中表达并分离纯化的重组酶：PNGase F 基因来源于Flavobacterium meningsepticum，分子量为36kDa；O-Glycosidase基因来源于Enterococcus Faecalis，分子量为147kDa；α2-3,6,8,9 Neuraminidase基因来源于Arthrobacter ureafaciens，分子量为66KDa。

产品质量：

       SDS-PAGE分析，纯度≥95%；没有检测到污染的外切糖苷酶、内切糖苷酶及蛋白酶活性。

酶活定义：

      1个PNGase F酶活力单位定义：在10 μl反应体系中，37°C，pH7.5条件下，1小时内催化释放10μg变性RNase B＞95%N-连寡糖所需要的酶量。1U Rhinogen^® PNGase F=1 unit NEB PNGase F。

      1个O-Glycosidase酶活力单位定义：在100 μl反应体系中，37°C，pH7.5条件下，1小时内从5mg唾液酸酶消化后的非变性fetuin 上催化释放0.68nmol O-连二糖所需要的酶量。1U Rhinogen^® O-Glycosidase =1 unit NEB O-Glycosidase。

      1个α2-3,6,8,9 Neuraminidase酶活力单位定义：在37°C，pH5.5条件下，以对硝基苯基-α-D-N-乙酰神经氨酸为底物，1分钟内催化释放1 μmol 对硝基苯酚所需要的酶量。1U Rhinogen^® α2-3,6,8,9 Neuraminidase =1 U Prozyme Glyko^® Sialidase ATM。

储存条件：

       采用冰袋运输，收到产品后请立即将酶置于4℃，严禁冻存；配套试剂置于-20℃储存。本品不含防腐剂，务必确保无菌操作取用，避免污染。

产品特点：

       Rhinogen^® Protein Deglycosylation KitⅡ(for N-Linked & Simple O-Linked Glycans)具有稳定性高、比活性高等特点，是三种高度纯化和非常稳定的糖苷内切酶的组合，适用于蛋白质组学及糖生物学研究中糖蛋白上所有N-连聚糖及常见相对简单O-连聚糖的有效释放。

       1. 高纯度：没有污染蛋白酶/其它糖苷酶，纯度≥95％；

       2. 高稳定性：每批KitⅡ试剂盒中酶及试剂都经过严格的质量控制，以实现高稳定性；

       3. 高比活性：有效和完全的释放所有N-连聚糖及常见O-连聚糖；

       4. HPLC、MS兼容：试剂盒中所有的酶及试剂与下游HPLC及MS兼容。 

应   用：

       1. 聚糖结构分析;

       2. 结合位点及功能分析;

       3. 治疗性糖蛋白的表征及质量控制;

       4. 蛋白质组学分析，消除糖蛋白的异质性。

使用建议：

       1、变性条件下去糖基化方案：

       1）取10-100µg糖蛋白溶液，加入3µl 10×Denaturing缓冲液，补加纯化水使得反应体系为30µl；

       2）将上述30µl体系100℃处理10min，使糖蛋白完全变性；

       3）室温冷却5min；

       4）在上述变性体系中，分别加入5µl 10×Glyco缓冲液2、5µl 10% NP-40溶液、1-2μl PNGase F(Glycerol-free)、1-2μl O-Glycosidase、1-2μl α2-3.6.8.9Neuraminidase，补加纯化水至反应总体积为50μl，轻柔混匀；

       5）37°C 条件下反应1-5hr；

       注意：大多数糖蛋白样品在37°C 条件下反应1-5hr后能够被完全去糖基化；然而对于一些复杂的糖蛋白样品可能需要延长反应时间。

       2、非变性条件下去糖基化方案：

       1）取10-100µg糖蛋白溶液，加入5μl 10×Glyco缓冲液2、1-2μl PNGase F(Glycerol-free)、1-2μl O-Glycosidase、1-2μl α2-3.6.8.9Neuraminidase，补加纯化水至反应总体积为50μl，轻柔混匀；

       2）37°C 条件下反应4-24hr；

       注意：当对天然糖蛋白去糖基化时，建议将等量糖蛋白样品进行变性后再同步进行酶切去糖基化实验作为阳性对照，以确定非变性条件下去糖基化反应的程度。

操作说明：

       1. 上述操作方法旨在为Rhinogen^® Protein Deglycosylation KitⅡ(for N-Linked & Simple O-Linked Glycans)作为去糖基化试剂操作的一般指南，对于不同的糖蛋白样品，去糖基化活性高度依赖于反应条件，建议进行适当优化或根据经验确定最优的操作方法；

       2. 反应体系可以线性放大或缩小；

       3. 本产品适用于天然或者变性糖蛋白，当变性时，大多数糖蛋白能更有效地去糖基化。对于天然糖蛋白的去糖基化，可能需要更多的酶及更长的反应时间；

       4. 变性及非变性条件下的去糖基化处理方案得到的样品均与下游质谱兼容；

       5. Fetuin可用作有效的阳性对照。试剂盒提供的Fetuin浓度为10mg/ml；

       6. 本试剂盒不建议用于粘蛋白样底物（Mucin-like substrates）的去糖基化；

       7. 本产品仅供研究使用，不适用于人或动物诊断或治疗用途。