背景:

       支原体（Mycoplasma）是对支原体科、无胆甾原体科和螺原体科的原核微生物总称，是已知可以自由生活的最小生物，没有细胞壁，形状多样可变，直径一般是 0.1~0.3μm，基因组A-T 含量高，对常见的抗生素不敏感，对热敏感。目前已从污水、植物、动物、禽类、昆虫、人、温泉或其他高温环境中发现 200 种左右支原体。
     细胞如果受到支原体污染，细胞生长速度变慢，细胞产生病变或形态改变。连续培养细胞污染的概率大约15~35%，主要来源于 20 多种支原体，包括口腔支原体 （M.orale）、肺炎支原体（M.pneumoniae）、发酵支原体（M.fermentans）、精氨酸支原体（M.arginini）、莱氏无胆甾原体（A.laidlawii）和猪鼻支原体（M.hyorhinis）。
      人员操作、污染的细胞、原辅料（血清、胰酶、培养基），实验环境污染（生物安全柜、细胞间，培养箱）、实验仪器（水浴锅、液氮罐）、实验耗材（培养皿、方瓶、细胞工厂）都可能是污染源。污染了的细胞一方面对生产带来巨大影响，另外如果细胞产品、蛋白产品、病毒类产品受到支原体污染，最终会给患者带来潜在的健康风险。因此，监管部门要求企业对细胞库，检定用细胞和产品进行支原体检测，从源头上进行控制，尽早发现，确保放行产品不含支原体。对此，全球各国药物监管部门也发布了支原体检测相关指南，检测方法主要包括荧光染色法、培养法、生化检测方法和核酸扩增法。 上述检测方法中，大多操作步骤相对比较烦琐、灵敏性不高、不能区分支原体种类、需要特殊仪器或所需时间较长。而PCR法操作相对比较简单便捷，PCR扩增后通过电泳分析即可确定是否有支原体污染，并可根据扩增片段的大小大致预测至少11种所污染的支原体种属，也可以对PCR产物进一步测序以确定具体的支原体种属。

概述:

       Rhinogen^® Myco-Acid ^TM PCR支原体检测试剂盒是一种通过巢式PCR法（Nested PCR）检测培养细胞等生物材料中是否存在支原体污染的检测试剂盒。本支原体检测试剂盒是利用两对引物通过巢式PCR法特异性扩增支原体基因组DNA片段，从而实现对支原体的高灵敏度特异性检测的。

图1. Rhinogen^® Myco-Acid^TM PCR支原体检测试剂盒的检测原理图

      本试剂盒提供了PCR Mix（包含Taq DNA Polymerase、PCR Buffer、dNTP和Loading Buffer），扩增完毕后可以直接上样电泳，可快速、有效、高灵敏度地检测支原体污染。配套的阳性对照，便于确定PCR检测是否能正常工作及样品中是否存在抑制PCR反应的物质。原核生物的rRNA碱基序列非常保守，而rRNA操纵子上编码rRNA的DNA间隔区（space region）在各种生物种间的碱基序列差别很大，如16S和23S之间的间隔区。这个间隔区的DNA序列及长度在支原体各个种属间既有非常保守的部分，也有较大差异的部分。在编码16S和23S的保守区DNA上设计一对F1/R1引物，用于扩增16S和23S之间的间隔区，这就是巢式PCR的第一轮PCR（1st PCR），用于初步鉴定是否有支原体污染；然后在编码16S和23S rRNA的DNA间隔区的保守区上设计一条F2引物，在编码23S rRNA的DNA上设计一条R2引物进行巢式PCR的第二轮PCR（2nd PCR）。通过巢式PCR可以大大提高检测的特异性和灵敏度。

应用: 

      本试剂盒确定可以扩增的支原体种类及1st PCR和2nd PCR扩增产物长度参考如下表：

种属	GenBank	1st PCR（bp）	2nd PCR（bp）
Mycoplasma arginini	JN935883	370	145
Mycoplasma arthritidis	AY973560	408	157
Mycoplasma capricolum	AY800346	415	221
Mycoplasma fermentans	AY816338	492	195
Mycoplasma hominis	AY738737	370	148
Mycoplasma hyopneumoniae	JN935889	682	238
Mycoplasma hyorhinis	AY973572	452	211
Mycoplasma neurolyticum	AY796063	502	196
Mycoplasma orale	AY737010	424	179
Mycoplasma pulmonis	JN935865	477	190
Mycoplasma salivarium	AY786574	403	151
Ureaplasma urealyticum	AY741673	482	154

试剂包装: 

       Rhinogen^® Myco-Acid^TM PCR支原体检测试剂盒包装规格如下：

试剂组分	货号	规格
		25 T
PCR Mix	RA -MT06A	250μl
阳性对照	RA -MT06B	10μl
1st PCR Primer Mix	RA -MT06C	10μl
2nd PCR Primer Mix	RA -MT06D	10μl

产品特性:

      1. 操作简单：试剂盒提供预混好的试剂，使体系配制操作简便；
       2. 快速检出：通过PCR扩增及电泳分析进行支原体检出只需4-5小时左右；
       3. 灵敏度高：PCR反应非常灵敏，可以扩增目的基因序列超过1000万倍；
       4. 特异性高：使用巢式PCR反应，提高了检测特异性。

保藏条件:

       采用冰袋运输，收到产品后请立即置于-20℃及以下条件下储存。避免多次反复冻融。