内毒素存在于革兰氏阴性菌的外膜上，通过引发一系列免疫反应对人体健康构成威胁。因此，对其进行准确检测至关重要。
内毒素
内毒素（化学上称为脂多糖或 LPS）是一种固定在革兰氏阴性菌外膜上的成分。它可以分为三部分：暴露于外部环境的杂多糖O-抗原、具有胞内和胞外结构域的核心寡糖以及细胞膜下方的脂质A。根据其化学结构，LPS 属于两亲属性。
内毒素分子被脂质 A 锚定在细胞壁内，但会不断释放到周围的培养基中，不仅在细胞死亡时，而且在其生长和分裂过程中也是如此。一旦内毒素进入血液循环，免疫细胞对其进行识别，就会导致细胞内信号通路的快速激活，从而释放血管活性肽和细胞因子等促炎介质。上述过程可能导致发热、休克，甚至死亡。由于其在灭菌过程中对人体健康存在潜在危害且具有较高的化学稳定性，因此生物制品类、注射用药剂、抗生素类、疫苗等制剂以及医疗器材类必须经过细菌内毒素检验合格后才能使用。
内毒素检测的方法
多年来，用于检测和量化内毒素的测试方法不断发展，以提高其灵敏度。鲎变形细胞裂解物 (LAL) 测定是内毒素检测的药典测试。该测定的试剂是来自鲎 (Limulus) 变形细胞裂解物的冻干产物。除了 LAL 检测外，Tachypleus（另一种鲎）变形细胞裂解物 (TAL) 检测也被批准用于内毒素检测。
此外，随着重组C因子内毒素检测方案供应商越来越多，法规也越来越明朗，因此被广泛接受。其检测原理更为明确，原料可控，因此被用于更为准确的内毒素含量检测，成为传统鲎试剂检测的补充或替代方法。
无论哪种内毒素检测方法，整个检测体系正常工作的最重要的条件在于内毒素分子本身、酶、检测样品属性以及其他条件和谐共处，这些因素如果出现状况都会导致内毒素检测产生抑制或增强作用，统称干扰，导致结果不准确。
但是......不要怕，实验前，做到知己知彼，方能百战百胜！
我们来看看到底都有哪些会是内毒素检测的干扰因素。
首先，做实验的时候不淡定是最大的干扰因素，开个玩笑......
言归正传，真正的干扰一般来源于如下几个方面：
1、内毒素的自身属性
➤ 内毒素分子本身是两亲性的分子。两亲性导致内毒素会在水相中聚集分布，内部疏水，外部亲水。文献表明聚集体太大不利于内毒素活性显现，单体分布也不利于活性呈现。聚集-分散是一个动态过程，受到二价金属离子（Ca2+，Mg2+）和pH（H+）、非离子型去垢剂影响；
➤ 负电荷基团（PO43-，糖基）在一定条件下也会和正电荷位点或者阳离子相互结合。
2、样品环境，如温度，pH, 去垢剂，二价金属离子，渗透压等
➤ 低pH下，质子会和二价阳离子竞争，打破聚集体动态平衡；
➤ 二价金属离子（Ca2+,Mg2+）促进盐桥形成而促进LPS聚集，因此内毒素检测会受到金属离子螯合剂干扰，EDTA有六个金属离子配位点，因此干扰最强，其次是柠檬酸；
➤ 由于去垢剂也有两亲性，可能会取代内毒素并形成占位效应，导致聚集体组成变化形成干扰，其中PS-20扩散比PS-80快，因此PS-20干扰更大；
➤ 低温下（2-8℃或-20℃）聚集体形成较慢，同时非离子型去垢剂占位形成内毒素-去垢剂复合体的速度也比较慢，因此干扰会比较低；
➤ 过高浓度的盐或糖溶液（如50%的葡萄糖或5%的氯化钠溶液）通常会抑制试剂反应。因为高渗透压的溶液会从试剂吸水，从而使酶失活，造成抑制；
LPS聚集状态动态图（Johannes Reich et al., 2016）
3、样品属性，如电荷，亲水或疏水特性
➤ 正电荷蛋白结合内毒素负电荷位点。在阳离子蛋白溶菌酶、核糖核酸酶A 和人IgG样品内毒素检测中，发现了蛋白质对内毒素的掩盖，即使对样品进行稀释也无法解决。
➤ 蛋白和内毒素疏水相互作用，包裹内毒素导致活性无法检测
4、其他干扰成份（蛋白酶，抑制剂，复杂成份、佐剂）
➤ pH值在6～8范围酶活性最佳，因此样品pH值尽量不能低于5不能高于9；
➤ 高浓度变性剂会使得蛋白（酶）变性，丧失活性；
➤ 如反应体系中有蛋白酶，也会因为降解活性物质，如C因子，导致检测受到干扰，结果不准确；
➤ 丝氨酸蛋白酶抑制剂会抑制C因子底物酶切活性，干扰检测；
➤ 血清中复杂成份干扰等；
➤ 疫苗领域常会遇到的氢氧化铝佐剂吸附内毒素导致检测干扰问题。
以上只是把可能的干扰条件列举出来，我们真正在样品内毒素检测中，能够同时遇到2个以上问题就算中奖了。所以，我们要做的事情是，在遇到干扰的时候，理性分析样品属性，看看可能会是什么原因，然后对症下药，便可解决。
下一期，我们再看看以上问题可以如何解决，敬请期待…….
[1] Rui xuan Bu, Xinren Deng, Yuan Cao.Effect of different sample treatment methods on Low Endotoxin Recovery Phenomenon, Journal of Microbiological Methods,Volume 186, July 2021, 106241.
[2] Yuan Cao. Low endotoxin recovery and its impact on endotoxin detection, Biopolymers, Volume112, Issue11 November 2021
[3] Johannes Reich, Pierre Lang. Masking of endotoxin in surfactant samples: Effects on Limulus-based detection systems, Biologicals Volume 44, Issue 5, September 2016, Pages 417-422
[4] PDA Technical Report No. 82 (TR 82) Low Endotoxin Recovery, PDA, 2019.